Traditionen vil vide, at dronning Margrete 1. skulle have grundlagt Nyborg Kirke i 1388, men ifølge de nyeste undersøgelser af bl.a. Nationalmuseet, blev byggeriet af Nyborg Kirke – eller Vor Frue Kirke, som den egentlig hedder – påbegyndt ca. 1375, og pinsedag i 1428 blev kirken indviet til Jesu mor, Maria, af biskop Navne Jensen Krigebusk. Der er tegn på, at der har været en mindre, romansk kirke på stedet, som den nuværende kirke er bygget udenom, hvorefter den gamle kirke er blevet revet ned, da den nye kirke var parat til brug.
Kirkens fire vestlige fag var i begyndelsen af 1400-årene afsluttet mod øst af en nord-syd-gående mur. Inden 1428 var kirken forøget med de to østligste fag, kirkens nuværende kor, og - formodentlig - tre tilbyggede kapeller.
Omkring Reformationen var der opført tre sammenbyggede kapeller med et fælles tag på kirkens sydside, og Christian den 3. lod i 1550'erne kirken udvide med et ekstra sideskib mod nord i kirkens fulde længde.
Messeklokkespiret på østgavlen blev ifølge Nationalmuseets nyeste undersøgelser bygget samtidig med kirkens kor, og begge dele var der således, da kirken blev indviet i 1428. Messeklokken i det lille tårn blev brugt under nadveren i katolsk tid, når vin og brød ifølge katolsk tro reelt blev forvandlet til Kristi legeme og blod. En tradition der først ophørte med Reformationen i 1536.
Det store vesttårn blev bygget i 1581, og det høje spir - Danmarks højeste - blev sat på i 1589.
Vor Frue Kirke fremtrådte som en 5-skibet kirke frem til 1870.
I 1870-71 blev store dele af sideskibene nedrevet under ledelse af arkitekt Tvede. Derved fik kirken sit nuværende ydre udseende.
Kirkens orgel er bygget i 1973 af orgelbygmester Poul-Gerhard Andersen; København. Orglet er ombygget i 2021 af orgelbyggeriet Marcussen & Søn; Aabenraa, og har nu 44 registre, fordelt på 3 manualer og pedal. Det har primært mekanisk traktur og både mek. og elektrisk registratur samt sløjfevindlader. 4 af registrene er overflyttet fra et tidligere Demantorgel (1834), og 3 registre antages at stamme fra kirkens første orgel, bygget af Hans Brebus i 1596. Orglet rummer ca. 2.400 piber.
Nyborg Vor Frue Kirke fik i december 2011 et alterkors, som er skabt til kirken af billedkunstneren Maja Lisa Engelhardt (f. 1956).Korset er støbt i bronze i Pietrasanta i Norditalien og forgyldt med 24 karat bladguld hos forgylder Ove Olsen i Valby.
Det er ikke et krucifiks med den lidende Kristus ligesom kirkens gotiske korbuekrucifiks fra ca. 1390, men alterkorset har i sin form væksten i sig og er derved forbundet med korbuekrucifikset, som har spirer fra Livets Træ rundt i kanten.
Alterkorset er med sin bølgende form et træagtigt kors, som har en dynamisk kraft og vækst, og som ved forgyldningen har lyset i sig. Det leder tanken hen på det spirende, kommende opstandne liv. Nederst er det døde korstræ – det glatte, kantede stykke – og derfra vokser "Livstræets kors" nærmest organisk op med aftryk af olivengrene. Selv om det ikke er et kors med en skikkelse på, kan man alligevel ane åbenbarelsen af en velsignende skikkelse i det.
I 2015 blev en glasmosaik, skabt af kunstneren Maja Lisa Engelhardt, opsat i Nyborg Vor Frue Kirkes altervindue. Kunstværket er opsat i rammerne af det gamle altervindue fra kirkens indvielse til Vor Frue, Jesu mor Maria, i 1428.
Opstandelsesmotivet fra alterets livstræskors, som ligeledes er skabt af Maja Lisa Engelhardt til kirken i 2011, fortsætter op i vinduet, hvor træer med et grenværk, der skyder og går på tværs, og lyset i den iriserende glasmosaik symboliserer opstandelseshåbet.
Træet er et symbol på Jesus som "det sande vintræ". De sorte linjer, som går på tværs, giver mindelser om korsets linjer, men de virker samtidig perspektivisk som en vej – Jesus som "vejen, sandheden og livet". Og igennem dette sorte grenværk sitrer lyset i det iriserende glas. Opstandelsens lys. Den opstandelse, som ikke kan skildres i billeder og forstås med fornuften, kan således nærmest sanses i glasmosaikkens lys og farvespil.
Altervinduet er ligesom alterkorset forbundet med kirkens gotiske korbuekrucifiks, som stammer fra den første og ældste del af kirken, som blev taget i brug i slutningen af 1300-tallet.
Korbuekrucifikset har spirer fra Livets Træ rundt i kanten af korset, som også symboliserer opstandelseshåbet. Fra Kristi lidelse og død på korset, som det kommer til udtryk i Kristusfiguren på korbuekrucifikset, ser man nu også hen til opstandelsen, som det kommer til udtryk i altervinduets lys og grenværk. Langfredag er blevet til påskemorgen.
Udtrykket i "Opstandelsesruden" skifter med lyset i løbet af dagen – og mellem gråvejr og solskin og årstiderne. I dagslys kan det sortmalede grenværk i grisaillen, det gråmalede lag glas som ligger bag selve glasmosaikken, ses klart. Det andet lag glas med den iriserende glasmosaik har lyse, changerende, meget sarte pastelfarver, som ses mest tydeligt tæt på. Glasset næsten holder på lyset og slører det skarpe dagslys. I skumringstimen, "den blå time", mellem dag og aften bliver ruden helt speciel blå. Når det er mørkt udenfor, "forsvinder" grenmotivet, og alle glasmosaikstykkerne kan nu ses meget tydeligt, spillende i et perlemorsskær – og i alle regnbuens sarte farver dér, hvor det elektriske lys rammer. Om aftenen, hvis der er lys i kirken, kan "dagmotivet" så til gengæld ses tydeligt udefra ved kirkens østgavl.
Glasarbejdet er udført hos glarmester Per Steen Hebsgaards værksted i Præstø. Kunstværket er doneret til Nyborg Vor Frue Kirke af Augustinus Fonden.